http://www.ngn-intl.blogspot.com/

Resin (Binder)

Pigment dan Extender atau Filler

Solvent

Additive

http://www.geocities.com/heri_susyanto/ApakahCat.htm

Kultur jaringan bila diartikan ke dalam bahasa Jerman disebut Gewebe kultur atau tissue culture (Inggris) atau weefsel kweek atau weefsel cultuur (Belanda). Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma,

Dasar teori yang digunakan adalah teori totipotensi yang ditulis oleh SCHLEIDEN dan SCHWANN (Suryowinoto dan Suryowinoto, 1977) yang menyatakan bahwa teori totipotensi adalah bagian tanaman yang hidup mempunyai totipotensi, kalau dibudidayakan di dalam media yang sesuai, akan dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang sempurna, artinya dapat bereproduksi, berkembang biak secara normal melalui biji atau spora.

Teknik kultur jaringan menuntut syarat-syarat tertentu yang harus dipenuhi dalam pelaksanaannya. Syarat pokok pelaksanaan kultur jaringan adalah laboratorium dengan segala fasilitasnya. Laboratorium harus menyediakan alat-alat kerja, sarana pendukung terciptanya kondisi aseptik terkendali dan fasilitas dasar seperti, air listrik dan bahar bakar.

Pelaksanaan kultur jaringan memerlukan juga perangkat lunak yang memenuhi syarat. Dalam melakukan pelaksanaan kultur jaringan, pelaksana harus mempunyai latar belakang ilmu-ilmu dasar tertentu yaitu botani, fisiologi tumbuhan ZPT, kimia dan fisika yang memadai. Pelaksana akan berkecimpung dalam pekerjaan yang berhubungan erat dengan ilmu-ilmu dasar tersebut. Pelaksana akan banyak berhubungan dengan berbagai macam bahan kimia, proses fisiologi tanaman (biokimia dan fisika) dan berbagai macam pekerjaan analitik. Kadang-kadang latar belakang pengetahuan tentang mikrobiologi, sitologi dan histologi. Pelaksana juga dituntut dalam hal ketrampilan kerja, ketekunan dan kesabaran yang tinggi serta harus bekerja intensif.

Pekerjaan kultur jaringan meliputi: persiapan media, isolasi bahan tanam (eksplan), sterilisasi eksplan, inokulasi eksplan, aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri.

Dalam bab ini akan dibicarakan tentang beberapa pengetahuan antara lain tentang:

1. Sejarah Budidaya Jaringan Tumbuhan

2. Landasan Kultur Jaringan

3. Tipe-tipe Kultur Jaringan

4. Istilah-istilah Dalam Kultur Jaringan

5. Peranan Kultur Jaringan

6. Bahan Bacaan

7. Aktifitas Mahasiswa I

sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbayak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.

Sejarah Budidaya Jaringan Tumbuhan

Tokoh-tokoh yang berperan dalam sejarah dimulainya pengetahuan kultur jaringan antara lain adalah:

• Orang yang melakukan kultur jaringan adalah Gottlieb Haberlant pada tahun 1902.

• Tahun 1904 Hannig melakukan kultur embrio pada tanaman cruciferae.

• Knudson berhasil mengecambahkan anggrek secara in vitro di tahun 1922, pada tahun yang sama Robbins mengkulturkan ujung akar secara in vitro.

• Gautheret, nobecourt dan White yang menemukan auxin dan telah berhasil membudidayakan kalus pada tahun 1939.

• Skoog dkk. telah menemukan sitokinin dan orang pertama yang sukses dalam melakukan kultur jaringan pada tahun 1939.

• Tahun 1940 Gautheret melakukan ku.ltur jaringan kambim secara in vitro pada tanaman Ulmus untuk study pembentukan tunas adventif.

• Tahun 1941 Penggunaan air kelapa untuk campuran media dalam kultur Datura oleh van Overbeek.

• Pembentukan tunas adventif pertama pada kultur tembakau secara in vitro oleh Skoog pada tahun 1944.

• Baru pada tahun 1946, tanaman lengkap pertama dapat dihasilkan dari eksplan kultur tunas ujung pada Lupinus dan Tropaeolum oleh Ball.

• Pada tahun 1950 Ball mencoba menanam jaringan kalus tanaman Sequoia sempervirens dan dapat menghasilkan organ.

• Muir berhasil menumbuhkan tanaman lengkap dari kultur sel tunggal pada tahun 1954.

• Tahun 1955 Miller dkk. Menemukan kinetin yang dapat memacu pembelahan sel.

• Produksi tanaman haploid pertama dihasilkan oleh Guha pada tahun 1964.

• Laminar air flow digunakan pertamakali pada akhir tahun 60-an.

• Power mencoba melakukan penyatuan (fusi) protoplas pertama kali pada tahun 1970.

• Baru pada tahun 1971 tanaman lengkap dihasilkan dari eksplan protoplas oleh Takebe.

• Untuk mendapatkan tanaman yang tahan penyakit, Larkin pada tahun 1981 mengadakan penelitian variasi somaklonal yang pertama kali.

• Salah satu cara untuk mendapatkan kultuvar unggul adalah dengan melakukan transformasi. Transformasi sel pertama dilakukan oleh Horch pada tahun 1984.

• Trasformasi tanaman pertama dilakukan oleh IPTC pada tahun 1986.

• Transformasi wheat oleh Vasil pada tahun 1992.

• Pada tahun 1996 pelepasan pertama tanaman hasil transformasi genetik.

Landasan Kultur Jaringan

Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman, yaitu:

1. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengar benar dan sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua informasi tentang pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel. Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik.

2. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi organ baru.

3. Kompetensi menggambarkan potensi endogen dari sel atau jaringan untuk tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu. Cantohnya embrioagenikali kompeten cel adalah kemampuan untuk berkembang menjadi embrio funsional penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau morfogenetikali tidak mempunyai kemampuan.

Tipe-tipe Kultur Jaringan

Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas.

Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni:

1. Kultur biji (seed culture), kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling.

2. Kultur organ (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll.

3. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya.

4. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.

5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).

6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman, yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen (kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid.

Istilah-istilah (terminologi) Dalam Kultur Jaringan

1. Bahan tanam yang digunakan dalam kultur jaringan biasanya disebut dengan eksplan.

2. Kalus : a. suatu jaringan yang tersusun oleh sel-sel terdediferensiasi yang umumnya dihasilkan oleh jaringan yang luka atau kultur jaringan pada media yang berisi auxin tertentu atau

b. Pertubuhan aktif massa sel yang belum dan terdiferensiasi dan tidak terorganisir yang berkembang dari jaringan luka atau kultur jaringan yang ditanam pada media dengan tambahan zat pengatur tumbuh.

3. Dalam kultur jaringan, sering dilakukan pemindahan eksplan dari media I (untuk induksi kalus) ke media II (media untuk induksi organ tunas dan akar). Pemindahan eksplan dari media satu ke media lain (baik jenis medianya sama atau lain) dikenal dengan istilah subkultur.

4. Setiap masa inkubasi disebut passage. Passage pertama adalah subkultur pertama dari jaringan yang terbentuk dari eksplan awal.

5. Bahan yang diambil pada setiap subkultur disebut inokulum.

6. Kultur asenik adalah kultur dengan hanya satu macam organisme yang diinginkan.

7. Eksplan yang ditanam pada media tumbuh yang tepat, dapat beregenerasi melalui proses yang disebut organogenesis atau embriogenesis. organogenesis adalah proses terbentuknya organ-organ seperti pucuk dan akar.

8. Pucuk yang terbentuk pada tempat yang bukan jaringan asalnya (origin) yang biasa, disebut pucuk adventif. Seperti pucuk yang terbentuk dari kalus, hipokotil, kotiledon dan akar.

9. Embriogenesis adalah proses terbentuknya embrio somatik.

10. Embrio somatik (nonzygotic embryo) adalah embrio yang bukan berasal dari zigot, tetapi dari sel tubuh tanaman.

11. Bila embrio terbentuk dari kultur anther atau mikrospora disebut androgenesis, bila berasal dari ovari yang belum mengalami fertilisasi disebut gynogenesis.

12. Anakan tanaman yang telah lengkap memiliki organ daun, batang dan akar hasil kultur jaringan disebut plantlet (plantula).

13. Plantula yang akan dipindah ke lapangan dan diperlakukan sebagai bibit, harus mengalami masa adaptasi dari kultur heterotropik menjadi kultur autotropik. Masa adaptasi plantula disebut dengan aklimatisasi.

14. Pucuk-pucuk yang terbentuk dari jaringan kalus, terutama yang sudah mengalami subkultur, dapat bervariasi. Variasi-variasi ini disebut variasi somaklonal. Penyebab variasi ini belum diketahui dengan pasti, ada kemungkinan variasi ini sudah ada dalam eksplan asal karena sifat kromosom mosaic dalam sel-sel somatik ataupun terjadi akibat lingkungan dalam kultur.

15. Salah satu variasi yang terjadi adalah tanaman yang aneuploid yaitu tanaman dengan jumlah kromosom 2n-1 atau 2n+1.

16. Sel-sel dalam kalus atau sel-sel dari jaringan daun di-isolasi dengan perlakuan enzim merupakan bahan untuk memperoleh protoplasma. Protoplasma-protoplasma diperoleh dengan menghilangkan dinding sel dengan bantuan enzim-enzim cellulase, hemicelluase dan pektinase. Protoplasma kemudian dapat “dipaksa” untuk saling menempel dan bersatu membentuk suatu fusi sel. Proses ini merupakan bidang pemuliaan yang disebut hibridisasi genetik.

17. Hasil gabungan dua atau lebih protoplasma yang berbeda jenis dengan inti-intinya dikenal dengan istilah heterokarion.

18. Bila hanya sitoplasma yang bergabung maka disebut dengan cybrid.

Peranan Kultur Jaringan

A. Dalam bidang Hortikultura.

Kultur jaringan sudah diakui sebagai metode baru dalam perbanyakan tanaman. Tanaman yang pertama berhasil diperbanyak secara besar-besaran melalui kultur jaringan adalah tanaman anggrek, menyusul berbagai tanaman hias, sayuran, buah-buahan, pangan dan tanaman hortikultura lainnya. Selain itu juga saat ini telah dikembangkan tanaman perkebunan dan tanaman kehutanan melalui teknik kultur jaringan. Terutama untuk tanaman yang secara ekonomi menguntungkan untuk diperbanyak melalui kultur jaringan, sudah banyak dilakukan secara industrial. Namun ada beberapa tanaman yang tidak menguntungkan bila dikembangkan dengan kultur jaringan, misalnya: kecepatan multiplikasinya terlalu rendah, terlalu banyak langkah untuk mencapai tanaman sempurna atau terlalu tinggi tingkat penyimpangan genetik.

Dalam bidang hortikultura, kultur jaringan sangat penting untuk dilakukan terutama pada tanaman-tanaman yang:

1. Prosentase perkecambahan biji rendah.

2. Tanaman hibrida yang berasal dari tetua yang tidak menunjukkan male sterility.

3. Tanaman hibrida yang mempunyai keunikan di salah satu organnya (bentuk atau warna bunga, buah, daun, batang dll).

4. Perbanyakan pohon-pohon elite dan/atau pohon untuk batang bawah.

5. Tanaman yang selalu diperbanyak secara vegetatif, seperti: kentang, pisang, stroberry dll.

B. Dalam bidang agronomi

Kultur jaringan sangat membantu dalam usaha eliminasi patogen. Dengan metode ini dapat dipilih bagian atau sel-sel yang tidak mengandung sel-sel yang tidak mengandung patogen, terutama virus dan menumbuhkan sel-sel tersebut serta meregenerasikan kembali menjadi tanaman lengkap yang sehat. Secara konvensional tidak ada cara yang efektif untuk menghilangkan virus dari bahan tanaman. Kultur meristem yang disertai perlakuan temperatur 38-40oC selama beberapa waktu, dapat menghilangkan virus dari bahan tanaman. Bahan yang bebas patogen ini juga memudahkan pertukaran plasma nutfah internasional.

Seleksi tanaman merupakan kegiatan agronomi yang telah ada sejak manusia mulai membudidayakan tanaman. Pada metode konvensional, seleksi tanaman memerlukan jumlah tanaman yang banyak sekali pada lahan yang luas, dengan pemeliharaan yang intensif serta waktu yang lama. Dengan berkembangnya kultur jaringan, ditemukan hasil yang tidak terduga. Dalam kultur yang membentuk sel-sel bebas, terjadi variasi somaklonal dalam hal morfologi, produksi, pola pertumbuhan dan resistensi terhadap penyakit. Dengan media seleksi, beberapa lini-lini sel ini dapat dibedakan dari sel-sel lini yang biasa dalam beberapa petri-dish.

C. Dalam bidang pemuliaan tananaman

Dalam bidang pemuliaan tanaman yang komersial, banyak ditemui kegagalan pembentukan embrio yang viable. Kegagalan disebabkan oleh hambatan pada polinasi, pertumbuhan pollen-tube, fertilisasi dan perkembangan embrio atau endosperm. Setelah kultur protoplasma berkembang, diharapkan hambatan ini dapat dikurangai dengan metode fusi protoplasma atau injeksi organel dan sitoplasma dari sel yang satu ke sel lain.

Teknik kultur jaringan dapat diterapkan dalam bidang pemuliaan tanaman terutama untuk mempercepat pencapaian tujuan dan membantu jika cara-cara konvensional menemui rintangan alamiah. Melaui teknik kultur jaringan dapat dilakukan manipulasi sebagai berikut:

1. Manipulasi jumlah kromosom melalui bahan kimia atau meregenerasikan jaringan tertentu dalam tanaman seperti: endosperma yang mempunyai kromosom 3n.

2. Tanaman haploid dan double haploid yang homogeneous melalui kultur anther atau mikrospora.

3. Polinasi in vitro dan pertumbuhan embrio yang secara normal abortif.

4. Hibridisasi somatik melalui teknik fusi protoplasma baik intraspesifik maupun interspesifik.

5. Variasi somaklonal.

6. Transfer DNA atau organel untuk memperoleh sifat tertentu.

BAHAN BACAAN I

1. Chawla, H.S., 2004. Introduction to plant biotechnology. 2nd ed. Science publishers,Inc. New Hampshire .

2. Drew, R., M. Smith, J. Moisander & J. James, 1991. Plant tissue culture general principles and commercial applications. Queensland Department of Primary Industries. Brisbane. 31 p.

3. Dixon, R.A., 1985. Plant cell culture a practical approach. IRL Press Limited. England. 236 p.

4. Dodds, B., 1993. Plant tissue culture for horticulture. Queensland University of Technology Printing Unit Garden’s Point Campus. Queensland. 80p.

5. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge University Press. London. 178 p.

6. Ganapathi, T.R., N.S. Higgs, P.J. Balint-Kurti, C.J. Arntzen, G.D May, and 7 J.M. Van Eck, 2001. Agrobacterium -mediated transformation of embryogenic cell suspensions of the banana cultivar Rasthali (AAB). Plant cell reports (2001) 20: 157-162.

7. George, E.F. & P.D. Sherrington. 1984 Plant propagation by tissue culture. Handbook and directory of commercial laboratories. Exegetics Ltd., Basingstoke, England. 546p.

8. Green, E.F. D.A. Somers, W.p. Hackett & D.P. Biesboer, 1987. Plant tissue and cell culture. Alan R. Liss, Inc. New York. 509 p.

9. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. In vitro plant Breeding. The Haworth Press, Inc. New York.

BAB II. Laboratorium dan Organisasi Kultur Jaringan

Dalam kultur jaringan, pertumbuhan eksplan atau inokulum diusahakan dalam lingkungan aseptik dan terkendali. Implikasi dari keadaan ini adalah bahwa setiap langkah dalam pelaksanaanya harus dilakukan dalam laboratorium. Laboratorium yang efektif merupakan salah satu unsur penting yang ikut menentukan keberhasilan suatu kegiatan, baik untuk keperluan peneletian, maupun produksi. Laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga setiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainya, tetapi juga saling berhubungan dan mudah dicapai.

Penataan ruangan dalam laboratorium, dikaitkan dengan langkah-langkah dalam prosedur kultur jaringan dan alat-alat yang diperlukan. Kegiatan kultur jaringan di dalam laboratorium, dibagi dalam 3 kelompok yaitu : (1) Persiapan media dan bahan tanaman. (2) Isolasi dan penanaman. (3) Inkubasi dan penyinaran kultur.

Masing-masing kegiatan harus terpisah satu dengan lainya, dengan peralatan yang tersendiri, karena kegiatan-kegiatan tersebut, maka ruangan yang dibutuhkan adalah :

1. Ruang persiapan dan ruang stok

2. Ruang isolasi dan penanaman.

3. Ruang kultur.

4. Ruang kantor.

5. Ruang mikroskop atau ruang analisa.

Ruang kultur biasanya merupakan ruang yang terbesar dari ruang laboratorium dan harus dipikirkan kemungkinan perluasan. Ruang persiapan dan ruang transfer tergantung dari jumlah dan besar alat-alat, sedangkan ruang stok merupakan ruangan terkecil dan tergantung dari macam pekerjaan, kadang-kadang dibutuhkan ruang mikroskop dan/atau ruang analisa. Ukuran tiap ruangan sangat tergantung dari: A. Alat-alat yang dipergunakan; B. Jumlah personalisa yang terlibat; C. Tujuan pekerjaan; D. kapasitas produksi; E. Biaya yang tersedia.

Ruangan laboratorium harus dijaga tetap bersih, serta bebas dari hewan kecil seperti tikus dan insek (lalat, semut, kecoa dan lain-lain). Sarana dasar seperti : aliran listrik yang cukup, air yang lancar, dan gas, merupakan perlengkapan yang dapat dikatakan harus dimiliki.
1. Ruang persiapan dan ruang stok

Ruang ini merupakan bagian pusat kegiatan laboratories dimana sebagian besar aktifitas kegiatan dikerjakan diruang ini. Aktifitas-aktifitas yang dikerjakan disini antara lain mempersipakan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium dan tempat menyimpan alat-alat gelas. Fasilitas yang dibutuhkan dalam ruangan ini adalah meja tempat meletakkan alat-alat pemanas, meja untuk alat-alat timbang, meja untuk bekerja dan tempat mencuci.

Persiapan media meliputi penimbangan bahan, pengenceran media, penuangan ke dalam wadah kultur dan sterilisasi. Persiapan bahan tanaman meliputi pencucian kotoran-kotoran dari lapangan, pembuangan dan pemotongan bagian-bagian yang tidak diperlukan serta perlakuan awal untuk mengurangi sumber kontaminasi yang ada pada permukaan bahan tanaman.

Peralatan yang diletakkan dalam ruangan ini terdiri dari :
1. Timbangan analitik timbangan makro.
2. Refrigerator , Freezer dan desikator.
3. Hot plate yang dilengkapi stirrer atau kompor gas
4. Stirrer dengan magnetic stirrer.
5. Autoklaf vertical atau horizontal.
6. Microwave oven.
7. pH meter.
8. agar dispenser.
9. Oven.
10. Destiltor
11. Water bath yang dilengkapi pengatur temperatur
12. Centrifuge dan Vortex
13. Alat-alat gelas standard, antara lain: labu takar berbagai ukuran, pipet biasa dan mikro pipet, erlenmeyer berbagai ukuran (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml), gelas piala berukuran (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml), pengaduk gelas, wadah kultur : botol, tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur dalam berbagai ukuran.
17. Alat untuk mencuci.
18. Rak-rak pengering.
19. Lemari alat-alat, bahan kimia, serta bahan-bahan lain (alumunium foil, kertas timbang, karet gelang dan sebagainya).
20. Alat-alat kecil: spatula, pisau , scalpel dan pinset.
21. Fume hood (ruang asam)
22. Hood tempat penimbangan bahan-bahan yang carcinogenic.
23. Kereta dorong (cart) untuk memudahkan pemindahan alat-alat dan media dari ruang satu ke ruang lainnya.

Tata Tertib Dan Keselamatan Kerja di Dalam Laboratorium Kultur Jaringan
Jumlah orang yang di dalam ruangan kultur jaringan usahakan sesedikit mungkin atau yang berkepentiangan saja, usahakan tidak sampai berjubel-jubel.
Usahakan ruangan selalu bersih dari barang-barang yang kotor, barang yang kotor usahakan untuk segera dicuci atau dibersihkan.
Tidak diperkenankan menyimpan atau melakukan kegiatan makan dan minum di Ruang penabur/ steril dan ruang inkubator
Pastikan sebelum meninggalkan ruang inkubator pintu inkubator dalam keadaan tertutup rapat.
Semua bahan kimia yang masih baru dan akan dibuka harus diberi label: inisial nama pembuka dan tanggal dibukanya tutup segel tersebut. Begitu juga bila menyimpan larutan kimia atau larutan stok yang baru dibuat, harus diberi label: Nama senyawa, konsentrasi dan tanggal dibuat lalutan.
Hati-hati dalam membuang pecahan pipet pastur, peralatan gelas, bekas jarum suntik, sebaiknya diletakkan dalam wadah tersendiri yang aman dari jangkauan orang.
Hemacytometer harus dicuci menggunakan alkohol 70% dan dibungkus sebelum disimpan, jangan ditinggalkan disembarang tempat.
Usahakan bersihkan tempat kegiatan (meja) dari tumpahan cairan atau serpihan bahan tanam atau media dengan menggunakan alkohol 70% dan jangan meninggalkan meja dalam keadaan kotor, pastikan selesai tepat pada waktunya, sehingga tidak merepotkan orang yang akan bekerja setelah anda.
Jangan lupa mengisi buku kerja lab yang telah tersedia di lab. Apa yang telah dikerjakan pada hari, tanggal dan jam tersebut.
Jangan menggunakan pipet yang masih tertutup kapas, pastikan kapas dibuka terlebih dahulu sebelum digunakan.
Letakan semua peralatan yang telah digunakan dan telah dicuci pada tempatnya bila tidak tahu atau tidak dapat meletakkan pada tempatnya, bertanyalah atau minta tolonglah kepada laboran untuk membantunya.
Ruang di dalam kulkas sangat terbatas, aturlah tempat media anda sehingga tidak memenuhi isi kulkas.
Usahakan jangan menggunakan larutan stok orang lain tanpa permisi, bila ingin menggunakannya hendaknya bertanya dan minta izin terlebih dahulu.
Tekan off laminar air flow setelah selesai kegiatan dan tekan on pada lampu UV setelah meja LAF dibersihkan.
Usahakan seminimal mungkin membuka dan menutup ruang incubator.
Sebelum bekerja bila menggunakan sarung tangan jangan lupa sarung tangan disemprot menggunakan alcohol 70% atau spiritus. Bila tidak menggunakan sarung tangan maka telapak tangan harus dilap dengan alcohol 70% atau disemprot spiritus terhebih dahulu sebelum bekerja.
Pastikan semua peralatan seperti skalpei, pinset, cawan Petri, botol kultur disemprot menggunakan alcohol 70% atau spiritus.
Bila kultur terkontaminasi, kuiltur tersebut segera dikeluarkan dari ruang incubator dan tutup aluminium foil tidak diperkenankan dibuka diruang inkubator tersebut.
Pemakaian Alat dan Instrument Lab
Pastikan bila anda tahu cara mengoperasikannya, bila belum tahu tata caranya mintalah bantuan kepada laboran untuk membantu anda.

Penggunaan Timbangan Analitik/mikro
Pintu dorong timbangan pastikan tertutup bila timbangan tidak digunakan.
Setelah menimbang, bersihkan piringan timbangan dan ruangan disekitar piringan dengan menggunakan kuas atau sikat. Jangan pernah membebani piringan jika timbangan tidak digunakan.
Tidak boleh menimbang barang melebihi 100 gram atau kapasitas untuk timbangan mikro.

Penggunaan pH Meter
Letakan pH-meter pada keadaan standby on jika tidak dipakai; jangan ditekan off.
Siramlah electrode dengan aquadest perlahan sebelum digunakan. Siramlah electrode dengan aquadest kembali sesudah digunakan dan letakan pada silinder kembali.
Jangan dibiarkan elektrode diluar larutan pada waktu yang lama.

Ruang Stok
Ruang stok sangat diperlukan untuk menyimpan larutan stok makronutrien, mikronutrien, senyawa khelat (Fe-EDTA), vitamin dan zat pengatur tumbuh. Pada skala laboratories ruang stok cukup kulkas (refrigerator), freezer, akan tetapi untuk skala industri dibutuhkan ruangan yang lebih besar, sehingga ruang ini berupa kamar yang berukuran sesuai kebutuhan, misalnya berukuran 3 x 3 x 3 m3 .

Untuk meningkatkan efisiensi kerja dalam pelaksanaan kultur jaringan, keperluan dalam tiap tahapan kerja sudah direncanakan terlebih dahulu. Sebelum pekerjaan penanaman baru dan subkultur rutin dilakukan, media tumbuh sudah dipersiapkan minimum 3 hari sebelum diperlukan. Media-media yang dipersiapkan ini harus disimpan di ruang yang dingin dan gelap. Ruang untuk penyimpanan media-media yang disediakan ini disebut ruang stok. Ruang stok harus berhubungan langsung 2 arah, satu arah dengan ruang persiapan dan arah lain dengan ruang transfer. Kebersihan ruangan harus diperhatikan. Tidak ada alat-alat yang diletakkan dalam ruang stok, Hanya perlu rak-rak untuk meletakkan media. Larutan stok yang sudah mengalami pengendapan atau terkontaminasi sebaiknya tidak digunakan lagi dan segera dikeluarkan dari ruang stok supaya tidak memenuhi ruangan.

2. RUANG ISOLASI DAN PENANAMAN

Ruang isolasi sering diistalahkan dengan ruang steril atau ruang tabur. Ruangan ini untuk skala laboratories biasanya tidak begitu luas karena biasanya berisi satu laminar air flow yang diperuntukkan untuk seorang atau dua orang bekerja di dalamnya, akan tetapi untuk skala industri ruangan ini biasanya luas atau sangat luas tergantung berapa kapasitas orang yang bekerja sacara bersama-sama seperti gambar dibawah ini.

Ruang penabur harus selalu terjaga kebersihannya atau kesterilannya. Setiap akan dan selesai kegiatan penanaman eksplan selalu dibersihkan dan disterilkan menggunakan alcohol 70% atau spiritus, terutama pada meja laminar air flow, sedangkan lantai dan dinding ruangan dibersihkan dengan larutan pembersih lantai yang dilengkapi oleh desinfektan.

Di dalam ruangan Laminar air flow biasanya dilengkapi dengan lampu UV untuk sterilisasi ruangan di dalam LAF tersebut. Alat-alat yang selalu tersedia di dalam ruangan penabur selain LAF, adalah lampu Bunsen, hand sprayer, peralatan untuk isolasi eksplan yang sudah disterilkan dan rak dorong.

3. RUANG KULTUR

Teknik kultur jaringan akan berhasil sukses bila dikerjakan di dalam laboratorium yang bersih dan steril, ruangan yang kering dan dilengkapi untuk memproteksi spora udara dari mikroorganisme. Sangat dianjurkan ruangan selalu bebas dari debu, sebelum melakukan segala aktifitas. Kultur jaringan tanaman harus diinkubasikan di bawah kondisi temperatur, pencahayaan, fotoperiode, kelembaban dan sirkulasi udara yang terkontrol.

Ruang inkubasi kultur biasanya merupakan ruang besar dengan kemungkinan perluasan bila diperlukan. Pertambahan kultur terjadi secara periodik disebabkan pertumbuhan satu jenis atau penambahan jenis kultur baru. Kultur yang tumbuh dan telah memperbanyak diri, secara teratur harus disubkultur. Tergantung dari jenis tanaman dan besarnya wadah kultur, subkultur dapat dilakukan setiap 4-6 minggu sekali. Hal ini berarti tiap bulan ada pelipatan jumlah kultur.

Botol kultur, biasa diatur pada rak-rak terbuka yang bersusun untuk menghemat area. Jarak antara tiap lapisan rak pada umumnya 40-50 cm. Jarak antara rak harus diatur sedemikian rupa sehingga memudahkan lalu lintas pemeriksaan kultur. Di dalam ruang kultur pada keadaan tersusun di rak, lingkungan fisik pertumbuhan diatur sedemikian rupa sehingga mendukung pertumbuhan yang optimal. Studi yang sistematik tentang efek lingkungan ruang kultur untuk tiap tahap pertumbuhan eksplan, sangat jarang dilakukan. Namun secara garis besar, ruang kultur harus mempunyai pengaturan terhadap temperatur dan cahaya.

Eksplan memang sudah dipenuhi kebutuhan karbohidrat dari gula dan media, sehingga cahaya untuk keperluan fotosintetis tidak begitu mendesak, tetapi cahaya amat penting untuk pengendalian perkembangan eksplan. Unsur-unsur dari cahaya yang perlu diperhatikan adalah kwalitas cahaya, panjang penyinaran, dan intensitas cahaya. Temperatur ruang kultur juga menentukan respon fisiologi kultur dan kecepatan pertumbuhannya.

Kualitas cahaya. Cahaya putih merupakan cahaya yang baik untuk pertumbuhan kultur. Lampu fluorescent biasa digunakan sebagai sumber cahaya dalam ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik dan sangat efisien dalam penggunaan energi bila dibandingkan dengan lampu pijar. Bentuk lampu memungkinkan penyebaran cahaya yang baik, dengan panas yang dikeluarkan relatif rendah. Pada lampu pijar, hampir 90 persen merupakan energi panas sehingga mempengaruhi temperatur ruangan. Kadang-kadang pada kultur tertentu, campuran cahaya dari lampu pijar dan fluorescent memberi pertumbuhan yang lebih baik.

Intensitas cahaya. Intensitas cahay yang baik dari lampu fluorescent adalah antara 1000-400 ft-c (1000-4000 lux). Murashige menyatakan bahwa pengaruh penyinaran dalam pertumbuhan asparagus, Gerbera, dan Saxifraga secara in vitro, yang terbaik dalah 1000 ft-c untuk multiplikasi tunas, dan 300-1000 ft-c untuk perakaran tunas. Intensitas cahaya diatur dengan menempatkan jumlah lampu dengan kekuatan tertentu pada jarak antara 40-50 cm dari tabung kultur, untuk luas area tertentu.

Panjang penyinaran. Total cahaya yang dibutuhkan suatu tanaman merupakan fungsi dari periode penyinaran. Berapa lama cahaya harus diberikan, tergantung dari jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Ada kultur yang membutuhkan penyinaran terus-menerus, tapi banyak juga penelitian yang memperoleh hasil bahwa penggunaan panjang penyinaran selama 14-16 jam memberikan hasil yang baik. Pada tanaman tertentu membutuhkan penyinaran 10 jam, dan sebagainya. Panjang penyinaran diatur dengan alat automatic time switch atau lebih umum disebut timer.

Temperatur. Temperatur di dalam ruang kultur diharapkan dapat diatur. Bila dapat, temperatur antara periode gelap dan terang diatur berbeda sehingga proses fisiologis yang diinginkan dapat terjadi. Banyak laporan menyatakan bahwa temperatur yang baik untuk pertumbuhan tanaman dalam in vitro antara 25-28⁰ C yang merupakan suhu ruangan normal. Beberapa perlakuan khusus kadang-kadang membutuhkan suhu yang rendah, misalnya untuk pengumbian pada kultur kentang, suhu yang diperlukan adalah 18-20^o C. Suhu ruangan di negara tropis dapat diturunkan dengan pemasangan AC. Pemakain AC mutlak, karena ruang kultur merupakan ruang tertutup yang sedikit sekali mempunyai aliran udara bebas.

Alat-alat yang diperlukan dalam ruang kultur adalah :

1. Rak-rak kultur 3-4 tingkat dengan lampu fluorescent atau lampu TL.

2. Timer untuk mengatur lama penyinaran.

3. AC dan remote untuk mengatur temperature.

4. Mikroskop binokuler dan mikroskop inverted.

5. Alat-alat penunjang (kertas millimeter, penggaris, alat pembesar, dan sebagainya).

6. Shaker horizontal dan fermentor.

7. Tangga-tangga pendek untuk keperluan memeriksa kultur di rak yang tinggi.

Gambar 11. Timer untuk pengaturan Lamanya lampu nyala dan mati.

4. Ruang Kantor

5. Ruang Kultur

5.

Dalam penelitian kultur jaringan, reaksi suatu kultur terhadap media perlakuan harus diikuti sejak awal inisiasi. Untuk membedakan struktur yang terbentuk pada awal perkembangan, diperlukan bantuan mikroskop. Untuk keperluan ini diperlukan stereoscope maupun inverted microscope.

Penelitian yang lebih canggih seperti protoplast fusion, micro-injection DNA atau organel ke dalam sel, memerlukan mikroskop dengan micro-manipular. Alat-alat mikroskop ini memerlukan ruang khusus yang kering dan bersih yang dilengkapi air conditioning sehingga kelembapan dan suhu ruangan dapat terkontrol. Dalam ruangan ini diletakkan alat-alat seperti : mikroskop yang dilengkapi kamera, gelas preparat dan penutup, homeositometer, AC dan termohigrometer.

1. Bhojwani & Razdan, 1983. Plant Tissue Culture: Theory and Practise.

2. Debergh & Zimmerman, 1990. Micropropagation: Technology & Application.

3. Dodds, L.H., L.W. Roberts, 1982. Experiment in plant tissue culture. Cambridge University Press. London. 178 p

4. Evan, Sharp, Amminoto & Yamada., 1983/1984. Handbook of Plant Cell Culture (Vols 1 – 4).

5. George, 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: Part 1 The Technology, Exegetics, London.

6. Green, Somers, Hacket & Biesboer, 1987. Plant Tissue and Organ Culture.

7. Gunawan, L.W., 1988. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor. Bogor.

8. Kantharajah, A.S., -. Plant tissue culture and crop improvement laboratory manual. Indonesia Australia Eastern Universities Project. Universitas Mataram. Mataram.

9. Pierik, 1987. In vitro Culture of Higher Plants.

10. Taji, A., P. Kumar and P. Lakshmanan, 2002. In vitro plant Breeding. The Haworth Press, Inc. New York.

11. Thorpe, 1981. Plant Tissue Culture: Methods & Applications in Agriculture.

12. Torres, 1989. Tissue Culture techniques for Horticultural Crops.

13. Trigiano, R.N. & D.J. Gray, 2000. Plant Tissue culture concepts and laboratory exercises. 2^nd Adt. CRC Press. New York.

BAB III TEKNIK ASEPTIK ( STERILISASI )

Sterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan mikroorganisme. Pemiliharaan suci hama dan penyakit (keaseptikan) atau kondisi steril sangat esensial untuk keberhasilan dalam prosedur kultur jaringan. Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur yanga akan digunakan, media kultur, peralatan yang akan digunakan dalam kegiatan penanaman eksplan dan eksplan yang akan dikulturkan itu sendiri. Pemeliharaan kebersihan udara di dalam ruang kultur dan lantai kultur dari debu itu dua hal yang sangat penting dan harus tetap terjaga kebersihannya. Laminar Air Flow (LAF) harus tetap terjaga kebersihannya dan sebaiknya alat yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman dan kultur mikrobiologi serta patogi terpisah. LAF yang digunakan oleh mikrobiologist dan patologist sebaiknya menggunakan LAF yang mempunyai arah blower dari atas ke bawah (aliran hembusan udara dari arah atas ke bawah) atau vertical airflow model sedangkan LAF yang digunakan untuk keperluan kultur jaringan mempunyai arah hembusan udara dari belakang ke depan atau horizontal airflow model

Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari :

1. Eksplan, baik eksternal maupun internal.

2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang paling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut.

3. Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril.

4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara).

5. Kecerobohan dalam pelaksanaan.

Berdasarkan perbedaan benda yang akan disterilkan, umumnya prosedur sterilisasi dapat dikelompokan dalam tiga kategori, yakni:

a. Sterilisasi lingkungan kerja.

b. Sterilisasi alat-alat dan media.

c. Sterilisasi bahan tanaman (eksplan).

Penanaman ekplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, sering kali dilakukan dalam kotak pindah steril atau dikenal dengan Laminar Air Flow cabinet. kotak pindah ini sudah disempurnakan dengan adanya aliran udara halus yang dihembuskan dari blower kira-kira 100 hembusan per menit, melalui suatu filter yang sangat halus sehingga mikrobia dapat tersaring olh adanya filter tersebut. Dengan demikian udara yang mengalir atau hembusan udara tersebut adalah udara steril yang dapat mencegah kontaminan yang berasal dari airborne selama kegiatan penanaman. Kotak pindah dengan aliran udara melalui suatu filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan pori-pori < 0.3 um.

Dulu, kotak pindah ini tertutup bidang mukanya selama masa pelaksanaan dengan pembukaan seminimum mungkin, hanya tempat memasukkan tangan, kotak pindah semacam ini disebut dengan entkas. Entkas ini dapat dibuat dari kaca semua atau kayu dan bagian mukanya saja yang terbuat dari kaca. Di dalam kotak ini terdapat lampu germisida yang memancarkan radiasi ultraviolet untuk mensterilkan permukaan tempat kerja dalam kotak pindah ini. Disamping lampu ultra violet, kotak ini dapat juga disterilkan dengan penyemprotan alkohol 70% atau formalin tablet atau larutan formalin.

Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam alcohol 70% atau dalam larutan kaporit atau dapat juga disemprot menggunakan spiritus (untuk menghemat biaya). Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara ½-1 jam untuk mematikan kontaminan di permukaan tempat kerja. laminar air flow cabinet harus dijaga dibersihkan dengan alkohol dengan menyalakan lampu ultra violet sebelum mulai bekerja atau sesudah melakukan kegiatan selama ½-1jam.

STERILISASI ALAT-ALAT dan MEDIA

Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api.

Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.

Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi, serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable, panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.

Autoklaf

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121^o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm.

Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :

1. Penguraian gula.

2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.

3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.

4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.

Bagian-bagian autoklaf :

1. Panci luar.

2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.

3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.

4. Katup pengeluaran uap.

5. Pengunci atau klem.

Sterilisasi Media Mmenggunakan Autoklaf Portable

(Pemanasan menggunakan api)

1. Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf besar.

2. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panel-dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel.

3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar .

4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat)

5. Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka.

6. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen.

7. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap.

8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave.

9. Tutup katup pengeluaran uap.

10. Amati kenaikan temperature dan tekanan.

11. Setelah tekanan mencapai 15 psi, api kompor dikecilkan.

12. Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat.

13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.

14. Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up

15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media.

Sterilisasi Aquadest dan Media Menggunakan

Autoklaf Listrik (Digital Atau Non Digital)

Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume antara 300 – 500 ml. Isi wadah tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet gelang.

Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm.

Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121^oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up).

Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA₃, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.

Sterilisasi Peralatan Kultur

1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan al-foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.

2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.

3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang.

5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121^o C pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai.

.

Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Sterilisasi menggunakan Oven

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160^o C. Setelah disterilkan dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan alumunium foil.

LAMINAR AIR FLOW

Laminar air flow cabinet adalah suatu alat yang digunakan dalam pekerjaan : persiapan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro. Alat ini diberi nama Laminar Air Flow Cabinet, karena meniupkan udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari, debu dan spora-spora yang mungkin jatuh kedalam media, waktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama (pre-filter), yang kemudian ditiupkan keluar melalui filter yang sangat halus yang disebut HEPA (High efficiency Particulate Air FilterI), dengan menggunakan blower.

Pada Laminar Air Flow Cabinet, terdapat 2 macam filter:

1. Pre-filter, yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu dan benda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5 mm sehingga efisiensinya dapat mencapai 95 mm untuk objek-objek yang ≥ 5 mm.

2. HEPA filter dengan pori-pori 0.3 mm dan terdapat pada bidang keluar udara kearah permukaan tempat kerja.

Pre-filter harus sering dibersihkan dengan cacum cleaner dan sebaiknya diganti 1 tahun sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge.

Laminar air flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu U.V., ada juga yang tanpa. Pada laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu U.V., blower harus dijalankan terus menerus walaupun laminar air flow cabinet tersebut sedang tidak dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja didalam laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu U.V., dianjurkan agar menyalakan lampu U.V. minimum 30 menit sebelum laminar air flow digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu U.V. harus dimatikan, sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu U.V., hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan.

Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet:

1. Lampu alkohol/Bacti cinerator.

2. Wadah alkohol: botol/gelas piala ≥ 250 ml.

3. Pinset, skalpel, gunting, dan jarum.

4. Petri-dish steril.

5. Disceting Microscope, bila sedang isolasi meristim.

6. Kertas tissue/kapas.

7. Sprayer berisi alkohol 70% (tidak harus dalam cabinet).

CARA MENGGUNAKAN

1. Nyalakan lampu U.V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.

2. Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet, disemprot terlebih dahulu dengan alcohol 70% atau spiritus.

3. Meja dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau spiritus untuk mensterilkan LAF.

4. Blower pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.

5. Nyalakan lampu dalam LAF.

6. LAF sudah siap untuk digunakan.

Hal yang perlu diperhatikan :

1. Jangan meletakkan lampu bunsen terlalu dekat dengan filter dan alkohol untuk merendam peralatan kultur.

2. Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media, dan lain-lain benda di depan tempat bekerja sehingga menghalangi aliran udara.

3. Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol (nyala api alkohol yang terdapat pada alat tanam, tidak terlihat dengan jelas di tempat

yang terang HATI-HATI !!!).

4. Jangan mendekati lampu bunsenl, dengan tangan yang baru disemprot alkohol atau spiritus.

5. Bersihkan Laminar Air Flow Cabinet, setelah selesai bekerja. Jangan meninggalkan botol bekas, kapas bekas, dan sebagainya di dalam LAF

Gambar 20: Isolasi eksplan dan penanaman eksplan dii dalam LAF

BAB IV MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN

PENDAHULUAN

Perkembangan yang sangat pesat tentang media nutrisi untuk pertumbuhan sel tanaman dimulai sejak tahun 1960-an dan 1970-an. Nutrisi dasar untuk kultur sel tanaman pada dasarnya mirip dengan nutrisi yang dibutuhkan oleh tanaman itu sendiri. Namun, variasi komposisi nutrisi tergantung pada sel-sel, jaringan-jaring, organ-organ dan protoplasma serta jenis tanaman yang akan dikulturkan. Sebelum pembuatan nutrisi media, satu hal yang sangat penting untuk diketahui terlebih dahulu adalah mengetahui tipe kultur yang mana yang akan digunakan, misalnya: kalus, sel, organ atau protoplas yang akan diteliti serta tujuan akhir dari penelitian tersebut. Tipe kultur yang berbeda akan mempunyai satu atau lebih komposisi media yang unik.

Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bergantung pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman menyediakan tidak hanya unsur hara makro dan mikro, tetapi sumber karbohidrat yang pada umumnya berupa gula menggantikan karbon yang biasanya dihasilkan dari atmosfer melalui melalui proses fotosintesis.

Hasil yang lebih baik dapat dijangkau/ diperoleh, bila ke dalam media tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh. Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen yang tidak jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air kelapa, yeast exstracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang lebih tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih merupakan komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek.

Fasilitas dan Peralatan Yang Digunakan Dalam

Pembuatan Media

Peralatan yang digunakan untuk pembuatan media antara lain, adalah:

1. Autoklaf atau dandang presto.
2. Timbangan analitik digital.
3. Kertas tissue, aluminium foil, plastik wrap, kertas wrap, label.
4. Peralatan gelas untuk kultur jaringan tanaman, antara lain: botol kultur, gelas piala, erlenmeyer, cawan petri, gelas arloji, gelas pengaduk, gelas ukur, labu ukur, pipet dan lain-lain.
5. Desikator.
6. Unit filter disponsible.
7. Kulkas dan freezer.
8. Magnetik stirrer yang dilengkapi dengan hot plate.
9. Microwave, oven atau kompor gas.
10. Trolley atau rak dorong,
11. pH meter atau pH stick.
12. Vortek.
13. Sumber air (Air sumur atau PDAM) dan sumber arus listrik.
14. Water bath yang dilengkapi pengontrol temperatur.

Persiapan Membuat Larutan Dalam Satuan (Unit)

Konsentrasi dari satu substrat tertentu dalam media dapat digambarkan dalam variasi satuan (unit) adalah sebagai berikut ini:

Satuan Berat digambarkan sebagai milligram per liter (mg/l atau dapat ditulis sebagai mgL^-1.

10^-6 = 1,0 mg/l atau 1 part per million (ppm) atau seper juta bagian.

10^-7 = 0,1 mg/l

10^-9 = 0,001 mg/l atau µg/l

Satuan Konsentrasi.

Satu molar larutan (M) suatu senyawa sama dengan massa molekul dalam gram per liter.

1 molar (M) = massa molekul dalam g/l.

1 mM = massa molekul dalam mg/l atau 10^-3 M.

1 µM = massa molekul dalam µg/l atau 10^-6 M atau 10^-3 mM.

Konversi dari mili molar (mM) ke mg/l.

Sebagai contoh, massa molekul auxin : 2,4 D = 221,0.

1 M larutan 2,4 D berisi 221,0 g/l.

1 mM larutan 2,4 D berisi 0,221 g/l = 221,0 mg/l

1 µM larutan 2,4 D berisi 0,000221 g/l = 0,221 mg/l

Konversi dari mg/l ke mili molar (mM)

Massa molekul CaCl₂. 2H₂O = 40.08 + 2 x 35..453 + 4 x 1.008 + 2 x 16 = 147.018

Massa atom: Ca = 40.08 ; Cl = 35..453 ; H = 1.008; O = 16

Jika 440 mg/l CaCl₂. 2H₂O akan di konversikan ke nM, maka:

Jumlah mg dari CaCl₂. 2H₂O

Jumlah mM CaCl₂. 2H₂O =

Massa molekul dari CaCl₂. 2H₂O

440

=

147.018

= 2.99 mM

Jadi 440 mg/l CaCl₂. 2H₂O = 2.99 mM.

Komposisi Media

Unsur hara di dalam media kultur tersusun atas beberapa komponen, sebagai berikut :

1. Hara makro yang digunakan pada semua formulasi media kultur.

2. Hara mikro selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media yang hanya menggunakan besi atau besi-kelat.

3. Vitamin-vitamin dan asam-asam amino serta N organik, umumnya ditambahkan dalam jumlah yang bervariasi.

4. Sumber energi dan karbon berupa gula, merupakan keharusan, kecuali untuk tujuan yang sangat khusus.

5. Persenyawaan-persenyawaan organik kompleks alamiah seperti: air kelapa, ekstrak ragi (yeast extract), juice pisang hijau, tauge, nanas, kentang dan sebagainya.

6. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT): ada beberapa jenis, antara lain: auxin, sitokinin, geberelin, asam absisat, etilin dan sebagainya. ZPT merupakan komponen penting dalam media kultur jaringan. Jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan sangat tergantung pada jenis taman dan tujuan dari kultur tersebut.

7. Buffer (chelating agent).

8. Bahan Pemadat. Bahan ini digunakan untuk membuat media padat, yang biasa digunakan adalah agar.

9. Arang aktif, berfungsi untuk menyerap senyawa toxic yang dihasilkan oleh eksplan sebagai anti oxidan juga sering digunakan untuk memacu pertumbuhan akar.

BAB V ORGAN KULTUR

Teknik kultur jaringan semakin berkembang dan popular sebagai salah satu alternatif dari propagasi tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagasi aseksual dan tujuan utamanya adalah membuat tanaman lebih unggul. Kesuksesan dari beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetic pada tanaman tingkat tinggi tergantung pada kesuksesan dari regenerasi tanaman in vitro.

Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ. Menurut Shabde – Moses & Murhasige (1979), Hannig, pada tahun 1904 telah berhasil mendapatkan kecambah tanaman jenis crucifer dari embrio-embrio yang diisolasi dari biji yang belum matang (immature). Pertumbuhan organ yang tidak terbatas didalam kultur in vitro, pertama diperlihatkan oleh White dalam kultur akar tomat sekitar tahun 1934.

Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun 1940-1960. Setelah itu penalitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Kultur pucuk atau maristem mempunyai aspek praktis sebagai cara perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit. Dewasa ini kultur maristem sudah merupakan tindakan komersial yang dikelola oleh perusahaan –perusahaan pembibitan.

Disamping kultur pucuk, pada tahun 60 an, kultur akar mendapat perhatian lagi pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi bahan sekunder, terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar. Namun kultur akar yang pertumbuhannya tidak terbatas tersebut, dewasa ini pada umumnya dipusatkan pada hasil transformasi dengan Agrobacterium rhizogenes yang merupakan kultur auksin autotroph.

Secara keseluruhan kultur organ dalam ilmu fisiologi dipergunakan dalam studi diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan lingkungan, dapat dieksplorasi antara lebih tepat dalam kultur in vitro. Organ-organ tanaman yang sering digunakan sebagai eksplan tergangtung dari jening tanamannya, organ tersebut antara lain adalah:

Tabel 8. Spesies dan organ tanaman serta teknik kultur jaringan yang digunakan

Bab VI PERBANYAKAN MIKRO (MIKROPROPAGASI)

Propagasi klonal in vitro dikenal dengan istilah mikropropagasi. Kata klon digunakan pertama kali oleh Webber untuk tanaman budidaya yang dihasilkan dari propagasi vegetatif. Jadi propagasi klonal adalah multiplikasi dari individu gen identik melalui reproduksi aseksual sedangkan klon itu sendiri adalah satu populasi tanaman derivat (turunan) dari satu individu tunggal yang dihasilkan melalui reproduksi aseksual.

Seiring dengan perkembangan pemahaman dan kemajuan kultur jaringan maka dewasa ini teknik-teknik kultur jaringan telah digunakan untuk berbagai tujuan termasuk industri bibit tanaman. Teknik perbanyakan mikro (mikropropagasi) telah lama digunakan dan merupakan salah satu contoh menarik dan klasik dari penerapan teknik kultur jaringan. Teknik ini dilakukan dengan cara menanam eksplan berupa pucuk beserta jaringan meristemnya yang dikenal sebagai teknik kultur pucuk (Shoot tip culture) atau menanam tunas lateral dengan satu atau lebih buku (single node and multiple node culture). Teknik terakhir juga dikenal dengan istilah in-vitro layering.

Perbanyakan mikro secara umum dapat diartikan sebagai usaha menumbuhkan bagian tanaman dalam media aseptis kemudian memperbanyak bagian tanaman tersebut sehingga dihasilkan tanaman sempurna dalam jumlah banyak. Tujuan utamanya adalah memproduksi tanaman dalam jumlah besar dan waktu yang singkat.

Teknik ini juga dikenal dengan upaya clonning untuk memproduksi klon tanaman dari jaringan vegetatif. Oleh karena itu tanaman yang dihasilkan melalui upaya clonning ini adalah identik atau serupa dengan induknya. Untuk mengenal lebih jauh tentang mikropropagasi lebih jauh akan dibahas tentang:

1. Manfaat Teknik Mikropropagasi.
2. Metode Perbanyakan Secara In-vitro.
3. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Keberhasilan Perbanyakan Tanaman Secara In-vitro.
4. Contoh Teknik Perbanyakan Tanaman Hortikultur

Manfaat Teknik Mikropropagasi Dalam Bidang Hortikultura

Teknik perbanyakan in-vitro ini dilakukan dalam industri bibit karena teknik ini memiliki manfaat , antara lain:

1. Dapat digunakan untuk memproduksi bibit dalam jumlah banyak dan waktu yang relatif singkat. Salah satu keunggulan mikropropagasi adalah perbanyakan organ tanaman yang dihasilkannya. Penggunaan hormon pertumbuhan sintetis memungkinkan perbanyakan eksplan dalam jumlah banyak dan waktu singkat. Perbanyakan di dalam wadah kecil memungkinkan dilakukan perbanyakan cepat ini. Dewasa ini telah dilakukan automatisasi dalam mikropropagasi menggunakan mesin pembuat media dan sterilisasi media, pemotongan dan sterilisasi ekspan yang dikendalikan dengan komputer sehingga dapat dilakukan perbanyakan secara lebih cepat dan lebih efisien.

2. Dapat menghasilkan bibit dengan ukuran seragam. Produksi klon secara in vitro dapat dikontrol lebih mudah dbandingkan produksinya dilapangan karena perbanyakan dilakukan dalam wadah kecil. Oleh karena itu bisa dihasilkan klon dengan ukuran yang seragam dalam saat yang bersamaan. Penanaman bibit yang seragam mempermudah pemeliharaan tanaman di lapangan dan panen dapat dilakukan secara serempak.

3. Tidak membutuhkan eksplan dalam jumlah banyak sehingga menghindari kerusakan tanaman induk. Sebaliknya stek, cangkok, penyambungan/penempelan yang intensif dari satu pohon induk dapat mengganggu pertumbuhan tanaman induk bahkan dapat merusaknya.

4. Dapat digunakan untuk perbanyakan cepat tanaman langka, tanaman dengan nilai ekonomis tinggi, atau varietas unggul hasil pemuliaan tanaman.

5. Dapat digunakan untuk memproduksi dan memperbanyak tanaman yang bebas virus melalui teknik kultur meristem. Penyakit virus menyebabkan banyak kerugian dan kehilangan produksi tanaman pertanian. Seringkali infeksi virus tidak menyebabkan gejala awal yang dapat dilihat, namun akan nampak mengurangi vigor atau penampilan tanaman dan menurunkan kualitas maupun kuantitas hasil. Dewasa ini belum ada cara pengendalian dan pemberantasannya yang efektif. Hal ini menjadi masalah bagi tanaman hortikultura yang diperbanyak secara vegetatif misalnya kentang dan jeruk karena virus akan terbawa oleh keturunanannya. Isolasi dan penaman jaringan yang bebas virus (meristem) secara in vitro telah berhasil memproduksi klon kentang dan jeruk bebas virus.

Selain manfaatnya tersebut, perbanyakan dengan teknik kultur jaringan ini juga memiliki kelemahan antara lain agar usaha ini berhasil diperlukan ketrampilan khusus, fasilitas pendukung produksi yang khusus, mungkin diperlukan metode-metode khusus untuk mengoptimalkan produksi masing-masing varietas tanaman dan spesies dan karena metode yang dewasa ini tersedia membutuhkan banyak tenaga kerja maka biaya produksinya umumnya tinggi.

Selain hal tersebut dapat terjadi variasi tanaman yang dihasilkan dari perbanyakan secara in-vitro sehingga tanaman yang dihasilkan berbeda dengan induknya. Variasi ini dikenal dengan istilah “variasi somaklonal” karena variasi muncul pada klon yang dihasilkan dari organ-organ somatik (vegetatif). Hal ini dapat terjadi karena tanaman terus menerus dan dalam waktu lama ditanam dan diperbanyak dalam media yang mengandung hormon pertumbuhan tertentu.

Variasi ini juga timbul bilamana eksplan ditanam dalam media yang memungkinkan terbentuknya kalus. Pembelahan sel yang sangat cepat pada kalus dapat mengakibatkan perubahan genetis sel-sel kalus akibat penyimpangan informasi genetis yang diterima oleh masing-masing sel kalus tersebut. Variasi somaklonal ini dapat dikurangi dengan cara:

1) membatasi jumlah sub-kultur dan perbanyaknnya,

2) menanam dalam medium tanpa hormon pertumbuhan untuk satu atau dua periode sub kultur dan

3) jika memungkinkan menghindari perbanyakan melalui kultur kalus. Namun pada beberapa jenis tanaman, terutama tanaman yang tidak bisa diperbanyak dengan stek dan sulit dirangsang pembentukan tunas-tunas adventifnya maka kultur kalus yang diregenerasikan melalui organogenesis dan embryogenesis merupakan alternatif perbanyakan yang memungkinkan. Apabila variasi somaklonal tidak dapat dihindari, perlu dilakukan pengujian sifat-sifat tanaman yang diregenerasikan sebelum klon dijual secara komersial.

Manfaat Mikropropagasi Dalam Pemuliaan Tanaman

Teknik mikropropagasi dalam pemuliaan tanaman pada umumnya digunakan antara lain, untuk:

1. Untuk menghasilkan tanaman bebas penyakit (nematoda, mycoplasma, viroid, virus, jamur dll.).
2. Menghasilkan kultivar baru atau tanaman superior, hybrid baru, seleksi dan klon local, genotip elit.
3. Menghasilkan galur tetua jantan steril.
4. Menghasilkan induksi mutan secara spontan
5. Membuat variasi genetik.

Sumber: http://e-learning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20I%20PENDAHULUAN/GAYA%20BELAJAR%20KULTUR%20JARINGAN%20MELALUI%20PUBLIKASI%20WWW.htm#DAFTAR

PengertianKultur jaringan/Kultur In Vitro/Tissue Culture adalah suatu teknik untuk mengisolasi, sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik,

Dasar Teori Kultur Jaringana. Sel dari suatu organisme multiseluler di mana pun letaknya, sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (Setiap sel berasal dari satu sel).

b. Teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap.
sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali.

Aplikasi Teknik Kultur Jaringan dalam Bidang Agronomia. Perbanyakan vegetatif secara cepat (Micropropagation).

b. Membersihkan bahan tanaman/bibit dari virus

c. Membantu program pemuliaan tanaman (Kultur Haploid, Embryo Rescue, Seleksi In Vitro, Variasi Somaklonal, Fusiprotoplas, Transformasi Gen /Rekayasa Genetika Tanaman dll).

d. Produksi metabolit sekunder.

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Regenerasi1. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro : pucuk aksilar, pucuk adventif, embrio somatik, pembentukan protocorm like bodies, dll

2. Eksplan

Eksplan adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.

3. Media Tumbuh

Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS.

Tabel 1. Komposisi media Murashige dan Skoog (MS)

___________________________________________________

Bahan Kimia Konsentrasi Media (mg/l)

___________________________________________________

1. NH4NO3 1650

2. KNO3 1900

3. CaCL2.2H20 440

4. MgSO4.7H20 370

5. KH2PO4 170

6. FeSO4.7H20 27

7. NaEDTA 37,3

8. MnSO4.4H20 22,3

9. ZnSO4.7H2O 8,6

10. H3BO3 6,2

11. KI 0,83

12. Na2MoO4.2H20 0,25

13. CuSO4.5H20 0,025

14. CoCl2.6H20 0,025

15. Myoinositol 100

16. Niasin 0,5

17. Piridoksin-HCL 0,5

18. Tiamin -HCL 0,1

19. Glisin 2

20. Sukrosa 30.000

____________________________________________________

4. Zat Pengatur Tumbuh TanamanFaktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.

5. Lingkungan TumbuhLingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.

II. MIKROPROPAGASI

Tahapan dalam Mikropropagasi Tanaman
a. Tahap I : Seleksi Tanaman Induk
Seleksi tanaman induk meliputi varietas dan bebas penyakit. Tahap ini dilakukan untuk mengeliminasi kontaminan pada tanaman yang ditujukan untuk memperoleh eksplan steril.
b. Tahap II : Inisiasi
Tahap ini bertujuan mendapatkan kultur aseptik dari tanaman induk yang terseleksi (eksplan yang steril) melalui proses sterilisasi eksplan.

c. Tahap III : Multiplikasi/Produksi Propagula
Tahap ini bertujuan memperoleh organ multiplikasi yang dapat menghasilkan tanaman baru, seperti tunas aksilar atau tunas adventif dll. Pada tahap inilah berapapun jumlah yang ingin kita capai dilakukan melalui beberapa kali sub kultur, seperti bagan di bawah.

(Pucuk tanaman berukuran 0.3-0.5 cm setelah disucihamakan dimasukkan ke dalam botol I) —> Menghasilkan 1 x 4 pucuk setelah 8 minggu —> Subkultur I (menjadi 4 kultur) —> Menghasilkan 4 x 4 pucuk setelah 4-6 minggu —> Subkultur I (menjadi 16 kultur) —> Menghasilkan 16 x 4 pucuk setelah 4 minggu —> Subkultur III (menjadi 64 kultur) —> Menghasilkan 64 x 4 pucuk setelah 4 minggu —> Subkultur IV (menjadi 256 kultur) —> Menghasilkan 256 x 4 pucuk setelah 4 minggu —> Subkultur V (menjadi 1.024 kultur)

d. Tahap IV : Aklimatisasi Plantlet

Tahap ini adalah memindahkan plantlet dari lingkungan in vitro ke ex vitro. Plantlet biasanya diaklimatisasi di rumah kaca/plastik. Hal yang perlu diperhatikan saat aklimatisasi plantlet adalah suhu udara, kelemabab cahaya, media aklimatisasi, dan cahaya. Fase ini merupakan fase kritis sebelum plantlet dapat ditanama di lapang.

III. LABORATORIUM dan TEKNIS PELAKSANAAN

Fasilitas yang diperlukan untuk Laboratorium Kultur Jaringan adalah :
1. Ruang persiapan
2. Ruang stok
3. Ruang transfer
4. Ruang kultur
5. Areal cuci
6. Areal persiapan aklimatisasi
7. Rumah kaca/rumah plastik
8. Nursery

Teknis Pelaksanaan di Laboratorium

A. Pembuatan Media MS

1. Siapkan 1 labu takar ukuran 1 L
2. Labu takar diisi dengan air destilata sebanyak 200 ml.
3. Stok dipipet sesuai dengan kebutuhan dan dimasukkan ke dalam labu takar.
4. Timbang gula sebanyak 30 g dan agar-agar sebanyak 7 g.
5. Gula dilarutkan dalam 200 ml air destilata dan kemudian dicampur ke dalam labu takar.
6. Volume ditepatkan hingga mencapai 1 liter.
7. PH larutan dengan pH meter atau kertas indikator pH. PH diusahakan 5,8-6.
8. Tuangkan larutan media dalam panci enamel besar, campurkan agar-agar kemudian didihkan sambil diaduk-aduk.
9. Tuangkan media dalam botol kultur setebal 1,5-2 cm.
10. Tutup botol kultur dengan aluminium foil atau tutup plastik khusus yang tahan panas.
11. Botol kultur disterilisasi dalam autoklaf selama 25-30 menit.

B. Sterilisasi eksplan (Salah satu alternatif )

1. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam cawan petri steril atau botol steril, tergantung dari ukuran eksplan yang digunakan.
2. Ke dalam botol steril dituangkan larutan Clorox 20% sampai bahan tanaman terndam. Kemudian dibiarkan selama 7 menit.
3. Sementara itu, cawan petri lain dengan air steril disiapkan.
4. Setelah direndam selama 7 menit dalam Clorox 20%, bahan tanaman dibilas dalam air steril di cawan petri kedua selama 5 menit.
5. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam larutan Clorox 10% selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril selama 5 menit.
6. Bahan tanaman direndam lagi dalam larutan Betadine 0.25% selama 3-5 menit.
7. Bahan tanaman dibilas dua kali dalam air steril dengan lama perendaman masing-masing 5 menit agar sisa-sisa Betadine pada eksplan dapat larut.
8. Bahan tanaman ditanam dalam media dengan menggunakan alat-alat yang sudah disterilkan.

C. Penanaman

1. Alat-alat dan lampu alkohol diletakkan agak di sebelah kanan. Lampu alkohol diusahakan tidak terlalu dekat dengan wadah alkohol maupun filter.

2. Sebelum mengambil bahan tanaman, pinset dicelupkan ke dalam alkohol 95% kemudian di bakar sampai alkohol yang melekat di pinset terbakar habis. Setelah itu didinginkan dengan cara meletakkannya di atas cawan petri steril.

3. Media tumbuh disiapkan. Tutupnya (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati supaya bagian dalam tutup (alumunium foil) tidak tersentuh. Tutup tersebut diletakkan di bagian kiri tempat kerja, dalam keadaan dalamnya menghadap ke atas ( dalam keadaan terlentang).

4. Botol dipegang dengan tangan kiri dalam keadaan miring. Mulut botol dibakar di atas api alkohol. Ketika membakar mulut botol, sebaikanya botol diputar dengan titik tengah lingkarannya sebagai poros agar seluruh bagian mulut botol terkena api secara merata. Pemutarannya dilakukan dengan hati-hati secara perlahan-lahan.

5. Dengan pinset steril yang sudah dingin, eksplan diambil dan dimasukkan ke dalam media.

6. Sebelum ditutup, mulut botol dan bagian dalam tutupnya (jika menggunakan alumunium foil) sebaiknya dibakar dulu.

7. Tutup botol dikencangkan dengan menggunakan karet gelang.

8. Label ditulis kemudian ditempelkan pada tutup.

Label ini berisi:

- Jenis tanaman (cukup kode).
- Bagian tanaman: daun, anther, pucuk, akar, dan sebagainya.
- Nama media (cukup kode).
- Tanggal penanaman.

9. Larutan HgCl2, bekas dikumpulkan dalam sebuah wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan mencemarkan sumber air minum, atau diuapkan sehingga diperoleh garam HgCl2 kembali.

D. Aklimatisasi

1. Perakaran planlet diperiksa: apakah terbentuk dari pucuk atau kalus; apakah sudah terbentuk bulu-bulu akar. Bulu-bulu akar lebih baik perkembangannya di media cair.

2. Planlet yang vitrous tidak akan tahan dikeluarkan dari botol, hanya planlet yang hijau kekar yang dapat bertahan. Oleh karena itu, harus dilakukan seleksi kultur.

3. Kultur yang akan dikeluarkan diberi intensitas cahaya yang tinggi selama 1-2 minggu.

Pada proses pemindahan, tindakan berikut perlu dilakukan:

1. Semua agar-agar dan bekas media dari planlet dicuci bersih karena media in vitro mengandung gula yang menarik serangga dan serangan penyakit.

2. Pada waktu pencucuian, diusahakan agar akar tidak sampai terputus.

3. Setelah dicuci, agar-agar dan bekas media dari plantlet direndam dalam larutan fungisida 2 g/l selama 30 menit.

4. Media tanam berupa kompos : pasir =1:1 (v/v) sebaiknya media steril/semi steril.

5. Setelah plantlet ditanam dalam pot kecil atau polibag kecil, tanaman disungkup dengan sungkup plastik. Sungkup plastik dapat secara individu maupun untuk beberapa pot.

6. Plantlet diletakkan pada tempat dengan intensitas cahaya 40-59%.

7. Temperatur aklimatisasi antara 25-30 0C. Temperatur lebih dari 30 0C dapat menyebabkan kematianplantlet. Pengaturan temperatur dapat dilakukan dengan penyiraman air secara berkala di atas sungkup.

8. Setelah 10-14 hari, sungkup dibika. Bila kelayuan plantlet masih terjadi , sungkup harus digunakan kembali. Setelah plantlet segar, sungkup dibuka kembali sampai akhirnya plantlet tidak perlu disungkup lagi.

9. Plantlet yang telah menunjukkan pertumbuhan dipindahkan ke nurseri dengan intensitas cahaya yang lebih tinggi. Setelah kuat, tanaman dipindah ke lapangan.

Sumber: http://www.situshijau.co.id/tulisan.php?act=detail&id=111&id_kolom=13

Perkembangan kultur jaringan di Indonesia terasa sangat lambat, bahkan hampir dikatakan jalan di tempat jika dibandingkan dengan negara-negara lainnya, tidaklah heran jika impor bibit anggrek dalam bentuk ‘flask’ sempat membanjiri nursery-nursery anggrek di negara kita

Indonesia memiliki keanekaragaman hayati yang luar biasa, salah satunya adalah anggrek, diperkirakan sekitar 5000 jenis anggrek spesies tersebar di hutan wilayah Indonesia. Potensi ini sangat berharga bagi pengembang dan pecinta anggrek di Indonesia, khususnya potensi genetis untuk menghasilkan anggrek silangan yang memiliki nilai komersial tinggi. Potensi tersebut akan menjadi tidak berarti manakala penebangan hutan dan eksploitasi besar-besaran terjadi hutan kita, belum lagi pencurian terang-terangan ataupun “terselubung” dengan dalih kerjasama dan sumbangan penelitian baik oleh masyarakat kita maupun orang asing.

. Selain kesenjangan teknologi di lini akademisi, lembaga penelitian, publik dan pecinta anggrek, salah satu penyebab teknologi ini menjadi sangat lambat perkembangannya adalah karena adanya persepsi bahwa diperlukan investasi yang ’sangat mahal’ untuk membangun sebuah lab kultur jaringan, dan hanya cocok atau ‘feasible’ untuk perusahaan.

Sementara itu hanya sebagian kecil pihak yang mampu melakukan pengembangan dan pemanfaatan anggrek spesies, khususnya yang berkaitan dengan teknologi kultur jaringan. Tidak dipungkiri bahwa metode terbaik hingga saat ini dalam pelestarian dan perbanyakan anggrek adalah dengan kultur jaringan, karena melalui kuljar banyak hal yang bisa dilakukan dibandingkan dengan metode konvensional.

Secara prinsip, lab kultur jaringan dapat disederhanakan dengan melakukan modifikasi peralatan dan bahan yang digunakan, sehingga sangat dimungkinkan kultur jaringan seperti ‘home industri’. Hal ini dapat dilihat pada kelompok petani ‘pengkultur biji anggrek’ di Malang yang telah sedemikian banyak.

Beberapa gambaran dan potensi yang bisa dimunculkan dalam kultur jaringan diantaranya adalah :

Kultur meristem, dapat menghasilkan anggrek yang bebas virus,sehingga sangat tepat digunakan pada tanaman anggrek spesies langka yang telah terinfeksi oleh hama penyakit, termasuk virus.

Kultur anther, bisa menghasilkan anggrek dengan genetik haploid (1n), sehingga bentuknya lebih kecil jika dibandingkan dengan anggrek diploid (2n). Dengan demikian sangat dimungkinkan untuk menghasilkan tanaman anggrek mini, selain itu dengan kultur anther berpeluang memunculkan sifat resesif unggul yang pada kondisi normal tidak akan muncul karena tertutup oleh yang dominan

Dengan tekhnik poliploid dimungkinkan untuk mendapatkan tanaman anggrek ‘giant’ atau besar. Tekhnik ini salah satunya dengan memberikan induksi bahan kimia yang bersifat menghambat (cholchicine)

Kloning, tekhnik ini memungkinkan untuk dihasilkan anggrek dengan jumlah banyak dan seragam, khususnya untuk jenis anggrek bunga potong. Sebagian penganggrek telah mampu melakukan tekhnik ini.

Mutasi, secara alami mutasi sangat sulit terjadi. Beberapa literatur peluangnya 1 : 100 000 000. Dengan memberikan induksi tertentu melalui kultur jaringan hal tersebut lebih mudah untuk diatur. Tanaman yang mengalami mutasi permanen biasanya memiliki nilai ekonomis yang sangat tinggi

Bank plasma, dengan meminimalkan pertumbuhan secara ‘in-vitro’ kita bisa mengoleksi tanaman anggrek langka tanpa harus memiliki lahan yang luas dan perawatan intensif. Baik untuk spesies langka Indonesia maupun dari luar negeri untuk menjaga keaslian genetis yang sangat penting dalam proses pemuliaan anggrek.

Buat Semua Pecinta Kultur Jaringan

Saya adalah Distributor Bahan kimia khusus Kultur jaringan
Dimana bahan kimia yang kami pegang adalah ” Duchefa Biochemical plant cell culture” dari Belanda
Duchefa biochemical terdiri dari :
1. kimia siap jadi (MS, Vacint, VW, CHU, Shenk dll)
2. Kimia tersendiri (NH4NO3, KNO3, KOH, Cacl, MgSO4, KH2PO4
3. Hormon dan ZPT ( IBA, IAA, Kinetin, 2,4D, Ga3, TDz dll
4. Anti biotik
5. Energi ( sukrose, glukose, fruktose
6. Pemadat ( Agarose, mikro agar, Gelrite phyto agar dll

Selain itu kami juga bisa membantu alat” kebutuhan kultur jaringan seperti :
1. Laminar air Flow cabinet (lokal dan luar)
2. Autoclave
3. balance
4. Ph meter
5. Peralatan tanam (glass ware, pipet, scalpel, forcep dll
6. Rak kultur
7. dll

Untuk mendapatkan Catalog Dari ” Duchefa Biochemical Plant Cell and Tissue kulture” silahkan hubungi kami

untuk informasi lebih lanjut hubungi kami:

Mahdi Ananda,SP
email : mahdianandass@yahoo.com
fax : 0251-7522060
phone : 08197593363 / 081318169558
Sumber: http://www.anggrek.org/sekilas-kultur-jaringan-anggrek.html/comment-page-2